分子生物学实验技术

分子生物学有哪些技术

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分子生物学有哪些技术

分子生物学的基本含义 分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、 生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。 二、分子生物学发展简史 分子生物学的发展大致可分为两个阶段。 1、准备和酝酿阶段 19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破： 确定了蛋白质是生命的主要基础物质 19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，酶是生物催化剂。20世纪20-40年代提纯和结晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黄酶、细胞色素C、肌动蛋白等），证明酶的本质是蛋白质。随后陆续发现生命的许多基本现象（物质代谢、能量代谢、消化、呼吸、运动等）都与酶和蛋白质相联系，可以用提纯的酶或蛋白质在体外实验中重复出来。 确定了生物遗传的物质基础是DNA 虽然1868年F.Miescher就发现了核素（nuclein），但是在此后的半个多世纪中并未引起重视。20世纪20-30年代已确认自然界有DNA和RNA两类核酸，并阐明了核苷酸的组成。由于当时对核苷酸和硷基的定量分析不够精确，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的结果，因而曾长期认为DNA结构只是“四核苷酸”单位的重复，不具有多样性，不能携带更多的信息，当时对携带遗传信息的侯选分子更多的是考虑蛋白质。40年代以后实验的事实使人们对核酸的功能和结构两方面的认识都有了长足的进步。1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA；1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了是遗传物质。 2、现代分子生物学的建立和发展阶段 这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。DNA双螺旋发现的最深刻意义在于：确立了核酸作为信息分子的结构基础;提出了硷基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。在此期间的主要进展包括： 遗传信息传递中心法则的建立 在发现DNA双螺旋结构同时，Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明；1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型；1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物；70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性做了分析研究；这些都逐渐完善了对DNA复制机理的认识。 在研究DNA复制将遗传信息传给子代的同时，提出了RNA在遗传信息传到蛋白质过程中起着中介作用的假说。1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补；逐步阐明了RNA转录合成的机理。 在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。50年代初Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体（microsome）是细胞内蛋白质合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设；1961年Brenner及Gross等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合；1965年Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构；特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码，随后研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性，从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。 上述重要发现共同建立了以中心法则为基础的分子遗传学基本理论体系。1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶，又进一步补充和完善了遗传信息传递的中心法则。 以上简要介绍了分子生物学的发展过程，可以看到在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，推动着整个生命科学的发展。至今分子生物学仍在迅速发展中，新成果、新技术不断涌现，这也从另一方面说明分子生物学发展还处在初级阶段。分子生物学已建立的基本规律给人们认识生命的本质指出了光明的前景，但分子生物学的历史还短，积累的资料还不够，例如：在地球上千姿万态的生物携带庞大的生命信息，迄今人类所了解的只是极少的一部分，还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律；又如即使到2005年我们已经获得人类基因组DNA3x109bp的全序列，确定了人的5-10万个基因的一级结构，但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调，要理解80%以上不为蛋白质编码的序列的作用等等，都还要经历漫长的研究道路。可以说分子生物学的发展前景光辉灿烂，道路还会艰难曲折。 三、分子生物学的主要研究内容 分子生物学主要包含以下三部分研究内容： 1.核酸的分子生物学 核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。 2.蛋白质的分子生物学 蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。 3.细胞信号转导的分子生物学 细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。

分子生物学技术的分类

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分子生物学技术的分类

目前，常用的分子生物学技术有如下几种 ： PCR- 单链构象多态性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR- SSCP 技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变,通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR 扩增后，其产物经变性后可以产生2 条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR- SSCP 分析的主要优点是简易且敏感性较高。但是该技术不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP 突变检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE 电泳就可能无法检出，在PCR 产物或待测DNA 小于200 bp 时，PCR- SSCP 分析能够检测出70%~ 95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。Wallace1997 年提出将PCR- SSCP 和异源DNA双链分析（heteroduplex analysis,HA) 相结合，称之为SSCP/ HA，部分PCR 产物经变性进行SSCP 分析以了解是否具有突变，其余PCR 产物直接用于电泳，以检出含有突变的异源DNA双链，电泳凝胶经银染，单链DNA所形成的带为橘黄或棕色，而双链DNA则表现为灰黑色。该综合手段可以单链构型多态性和异源双链构型分析两个不同的层次检出突变，是一种经济、迅速的突变检测手段，但无法提供突变位置的信息。PCR- SSCP 有许多改进技术，如RNA单链构象多态性法（PCR- rSSCP）、双脱氧测序单链片段构象多态分析（PCR- ddF）、限制酶指纹技术(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依据RNA构象对单个碱基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某类启动子，通过转录的RNA构象体的电泳迁移差异进行突变鉴别。PCR- ddF 法把PCR 产物转录，将转录物用反转录酶进行Sanger 双脱氧终止测序反应，通过观察非变性胶上经解链处理所产生的单链漂移、突变后终止片段的获得与缺失来判断突变。PCR- REF 法将RFLP 和SSCP 技术优势组合，将PCR 扩增的待测片段用5~ 6 种限制酶依次消化，混合并进行末端标记，最后经变性处理并在非变性凝胶上电泳分离，从而获得来自片段长度和片段构象的双重突变信息。 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段分辨率达一个碱基。当DNA 双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度（Tm) 低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT 碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR 产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE 敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE 方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp 以内可以达到95%。DGGE 的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使试验无法检出存在于高Tm DNA片段中的碱基替换。为了解决此问题，可以在一个PCR 引物的5 ' 端设计一段富含GC的尾巴，从而使PCR 扩增产物的一端富含GC 碱基对，保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE 的突变检出率接近100%，但DGGE 只能检测突变是否存在而不能确定突变的位置。DGGE 方法需要设计特定片段最佳的PCR引物以及最佳变性条件，这一过程比较复杂，梯度变性胶的制备需要的设备较昂贵，所以在常规实验室不易实施。 等位基因特异性扩增法（allele- specific amplificarion,ASA) 是基于PCR技术的一种单核苷酸突变检测法，是分析已知碱基替代或微小片段缺失和插入型突变的常规技术。在PCR 的引物设计中，根据已知突变位点性质在引物3 ' 端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补而只扩增突变型或野生型基因。ASA技术只需一步PCR反应，甚至无需电泳和标记技术。因其快速，重复性强，耗资少，无同位素污染以及高效性等特点，将成为有前途的适应于人群大规模突变筛查的方法。应用该方法最好避免错配碱基为G: T，这种错配可能引发扩增反应。 化学裂解错配碱基法（chemical cleavage mismatch,CCM) 通过化学修饰并切割异源DNA双链中错配碱基，达到检测点突变的目的。其原理是末端标记的DNA片段暴露于可以识别并修饰异源双链中错配碱基的化学试剂中（如错配的胞嘧啶可被羟胺修饰，错配的胸腺嘧啶可被四氧化锇修饰），被修饰的位点随即可被杂氮环已烷等化学物质裂解。DNA修饰裂解后，电泳观察DNA片段长度即可知道突变是否存在。该技术较其他突变检测系统有更多的优越性，可以扫描1~ 2 kb 的大片段DNA并在随后的顺序分析中定位突变位点，其效率可达100%。该手段通常首先对目标DNA和野生型DNA进行PCR 扩增，然后对野生型DNA扩增片段进行末端标记，标记片段作为探针与目标序列复性形成异源双链，用四氧化锇（OsO4） 或羟胺（hydroxylamine) 修饰并用哌啶（piperidine) 切割，聚丙烯酰胺电泳分离不同长度的片段。近年来，有人采用碳化二亚胺作为错配修饰剂，进一步提高了该方法的敏感性。CCM方法最初采用同位素DNA片段，用荧光标记代替同位素后，称之为荧光化学裂解错配碱基法（FCCM），该方法依然比较敏感并且安全，可检出95%~ 100%的错配。化学裂解错配碱基法的不足之处在于工作量大，需要使用有害化学物质作为试验用试剂。

分子生物学实验技术都有哪些

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分子生物学实验技术都有哪些

包含生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术等。

作为一本实验技术类专著，此书不仅较详细地阐述了有关技术的具体操作和程序，更着力于对各种技术的基本原理及其相关理论基础进行深层次的剖析。故此书不仅可作为从事生命科学，特别是分子生物学相关领域工作者的实验室必备参考工具书，同时也可供高校相关专业师生及科学工作者对分子生物学实验技术的理论做深入探讨时参考。

分子生物学中两项最重要的实验技术

提示：

分子生物学中两项最重要的实验技术

分子生物学中有很多实验技术，但是其中最为重要的两项实验技术为PCR和蛋白质电泳。 一、PCR技术。 PCR技术全称为聚合酶链式反应，是一种通过体外繁殖DNA序列的方法。它利用聚合酶酶和引物，在反应体系中对DNA序列进行循环扩增，并且可以在很短时间内扩增出数以万计的特定DNA序列。 PCR技术广泛应用于基因测序、DNA克隆、DNA指纹鉴定等领域，并为分子生物学的发展提供了强有力的工具。 二、蛋白质电泳技术。 蛋白质电泳技术是一种用于分离和鉴定蛋白质的方法。它利用电场将具有负电荷的蛋白质分子分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和两级电泳等不同方法进行蛋白质分离、检测和测量。 蛋白质电泳广泛应用于蛋白质组学、生物医学研究和生命科学等领域，并做出了许多重要的发现。 分子生物学的基本内容： 一、蛋白质体系。 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。 二、蛋白质分子结构。 蛋白质分子结构的组织形式可分为4个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。 三、分子生物学研究。 蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。